Elä ja hengitä Ezion, legendaarisen mestariassassiinin, roolissa hänen jatkuvassa taistelussaan mahtavaa temppeliritarikuntaa vastaan. Hänen on matkustettava Italian suurimpaan kaupunkiin, Roomaan, vallan, ahneuden ja korruption keskukseen iskeäkseen vihollisen sydämeen. Siellä vallitsevien korruptoituneiden tyrannien kukistaminen vaatii paitsi voimaa myös johtajuutta, sillä Ezio komentaa kokonaista veljeskuntaa, joka liittoutuu hänen puolelleen. Vain yhdessä työskentelemällä assassiinit voivat voittaa kuolevaiset vihollisensa ja estää veljeskuntansa tuhon. Ensimmäistä kertaa pelissä on myös ennennäkemätön moninpelikerta, jossa voit valita monista erilaisista assassiinihahmoista, joista jokaisella on omat ainutlaatuiset aseensa ja salamurhatekniikkansa, ja mitata taitojasi muita assassiinihahmoja vastaan eri puolilta maailmaa. On aika liittyä veljeskuntaan.